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应用RiboGreen荧光染料进行RNA精确定量

阅 11699次 / 原平皓生物
关键词: RNA精确定量, RNA定量, 荧光染料, PicoGreen

简介：

        RiboGreen RNA定量试剂是一种超灵敏的核酸荧光染料，使用这种染料可以对溶液中的RNA进行简单快速的定量。常规定量RNA的方法是在260nm处检测溶液的光吸收度，但是这种定量方法灵敏度差（4μg/ml RNA），且易受溶液中寡核苷酸、蛋白、盐离子等的影响。使用RiboGreen荧光染料可以避免上述这些问题。
        当RiboGreen荧光染料处于溶液状态时，其几乎没有荧光活性；当RiboGreen与RNA结合，其荧光活性将增加1000倍。RiboGreen-RNA复合物的荧光激发波长约500nm，发射波长约525nm。使用RiboGreen荧光染料可以检测到2.5ng/ml的RNA，这比260nm吸收法要高出千倍。

原理：

检测方法：

3. 实验方案

3.1 试剂的准备
注：试剂的处理、保存和应用应根据Molecular Probes, Inc提供的产品信息资料操作。

用超纯水将适量的20倍TE缓冲液稀释成1倍的，够当日实验用量即可。
Quant-iT RiboGreen检测试剂盒提供了1ml无水二甲亚砜的浓缩染料溶液，实验时需制备Quant-iT RNA工作液，可用1倍的TE（大范围25-1000ng/ml RNA）按1:200的比例，（小范围1-50ng/ml RNA）按1:2000的比例稀释浓缩染料液。溶液制备需用塑料器皿不能用玻璃器皿，因为试剂中某些成分会吸附到玻璃器皿表面。用箔金纸包裹或放置黑暗处避光保存。
注：溶液在制备后3小时内使用检测结果会比较好。

3.2 仪器准备

3.2.1 关掉ModulusTM单管型多功能检测仪电源开关，根据操作手册插入Blue荧光模块和微量适配器。
3.2.2 打开电源开关，校准前先预热1min。

3.3 校准

3.3.1 用1倍TE缓冲液稀释100 μg/ml的标准样至符合大小范围检测的需要。制备实验所需2倍浓度的标准样。例如，制备2000 ng/ml标准样，加RiboGreen工作液进一步将标准液稀释到1000ng/ml。
3.3.2 加50μl标准样至含相同体积RiboGreen工作液（步骤3.1中制备）的小离心管中，充分混合，将100μl混合液转到微量比色杯中，*小检测体积75μl。
3.3.3 用5个标准样来校准多功能机。选择“ng/µl”为测量单位，用浓度为0 ng/µl的标准样为空白对照。选择与典型样品*接近的5个标准样，可获得更佳性能和更高精确度。
3.3.4 保存这次校准数据以供将来使用（可选）

3.4 样品分析

3.4.1 加50μl待检样品至含相同体积RiboGreen工作液的小离心管中，颠倒混匀。
3.4.2 将100μl的检测样转到微量比色杯中。
3.4.3 读取每一样品，样品浓度会在多功能机显示屏上以ng/ml显示结果。
注：不必在校准后再次运行标准曲线；检测校准的线性，再次读取标准样。

参考文献：

  1. Anal Biochem 17, 100 (1966)
  2. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, J. Sambrook, E.F. Fritsch and T.Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989).

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