分泌型碱性磷酸酶（SEAP）发光检测
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原平皓生物
简介：
分泌型碱性磷酸酶（secreted alkaline phos-phatase，SEAP）是人胎盘碱性磷酸酶的突变体，*大特点是能由表达细胞分泌到细胞外，检测时可在不破坏细胞的情况下，任意时间点取细胞培养上清液进行重复、动态的检测，且被检测细胞还可继续其他用途。使用发光检测方法可以进一步提高SEAP的检测灵敏度。
原理：
检测方法：
以CLONTECH的Great EscAPe™ SEAP检测试剂盒为例
1. 试剂准备
a) 发光增强剂：将发光增强剂与buffer按比例混合（95ul+100ul每个样品），使用前平衡到室温
b) 稀释buffer：使用去离子水将5X Dilution buffer稀释为1Xbuffer
c) 化学发光底物：25mM的化学发光底物与发光增强剂以1：19的比例混合，避光保存
d) 阳性样品：在23ul空细胞的培养上清中，加入2ul的SEAP样品
2. 样品处理
a) 取25ul细胞培养上清，加入1.5ml离心管中
b) 加入75ul的1X Dilution buffer，混匀
c) 65℃热处理30min后，降温到室温
d) 加入100ul发光底物，室温下孵育30min
3. 检测结果
孵育结束后，放入发光检测仪检测发光值。
1. 试剂准备
a) 发光增强剂：将发光增强剂与buffer按比例混合（95ul+100ul每个样品），使用前平衡到室温
b) 稀释buffer：使用去离子水将5X Dilution buffer稀释为1Xbuffer
c) 化学发光底物：25mM的化学发光底物与发光增强剂以1：19的比例混合，避光保存
d) 阳性样品：在23ul空细胞的培养上清中，加入2ul的SEAP样品
2. 样品处理
a) 取25ul细胞培养上清，加入1.5ml离心管中
b) 加入75ul的1X Dilution buffer，混匀
c) 65℃热处理30min后，降温到室温
d) 加入100ul发光底物，室温下孵育30min
3. 检测结果
孵育结束后，放入发光检测仪检测发光值。
参考文献：
- Berger, J., Hauber, J., Hauber, R., Geiger, R. & Cullen, B. R. (1988) Secreted placental alkaline phosphatase: a powerful new quantitative indicator of gene expression in eukaryotic cells. Gene 66:1–10.
- Cullen, B. R. & Malim, M. H. (1992) Secreted placental alkaline phosphatase as a eukaryotic reporter gene. Meth. Enzymol. 216:362–368.
*如果您在实验中遇到任何问题, 请与我们的技术人员沟通, 我们将提供帮助.
联系电话: 010-5158 2336转803 电子邮箱: help
yph-bio.com
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